Des disques Blu-ray pour effectuer des analyses biologiques

Les outils d’analyse biologique ont récemment fait beaucoup de progrès, en sensibilité, en sélectivité et en rapidité . En particulier, la miniaturisation a permis de les rendre plus transportables grâce à la technique des micro-alignements. Celle-ci  consiste à fixer à intervalles réguliers sur divers supports de minuscules quantités de réactifs comme des acides nucléiques, des protéines ou des carbohydrates. Ils constituent autant de sondes dont on pourra lire les réactions à des agents spécifiques avec lesquels on les met en contact. Des chercheurs de l’Université Polytechnique de Valence, Espagne, dirigés par Ángel Maquieira avaient déjà utilisé comme support des disques DVD et CD et lu optiquement les résultats avec les lecteurs DVD et CD du commerce. Ils ont maintenant réussi obtenir des analyses rapides avec des disques Blu-ray. La diode laser des lecteurs Blu-ray fonctionne à une longueur d’onde optique plus courte (405nm) que les CD (780nm) et les DVD (650 nm). Ceci, joint à une ouverture de l’objectif plus élevée, permet de lire des micro-alignements de haute densité spatiale.

Fig.1. Schéma de la lecture d’un disque Blu-ray. On a figuré la carte d’acquisition du lecteur standard utilisé. Il est connecté à une entrée USB d’un ordinateur portable. Crédit Ángel Maquieira.

Fig.1. Schéma de la lecture d’un disque Blu-ray. On a figuré la carte d’acquisition du lecteur standard utilisé. Il est connecté à une entrée USB d’un ordinateur portable. Crédit Ángel Maquieira.

 

Les signaux de sortie de la diode de détection sont numérisés par l’électronique du lecteur. Ces signaux transmis à l’ordinateur sont traités par un programme spécifique écrit par les chercheurs en Visual C++. Si durant le balayage du disque par la tête de lecture, le faisceau laser rencontre un produit de réaction qui modifie la réflectivité de la surface du Blu-ray, le faisceau réfléchi est atténué. Durant le balayage du disque, les signaux provenant des surfaces réactives sont traités et transformés en images. Les données d’analyse sont traitées par le programme qui permet aussi de contrôler entièrement le lecteur.

La technique de dépôt des micro-alignements de sondes biomoléculaires

Un disque Blu-ray a une structure analogue à celle des CD et DVD.  Un disque de polycarbonate de 1,1 mm d’épaisseur est gravé d’un sillon de guidage de 0,32 µm de largeur. Il est recouvert de films diélectriques servant à l’enregistrement. Ceux-ci sont enduits d’une couche  transparente de 10 à 170 µm, qui comprend une couche finale anti-rayure de 2 µm d’épaisseur  fortement hydrophobe. Ceci favorisera la fixation  des sondes biomoléculaires qu’on déposera à sa surface.

Les disques sont lavés à l’éthanol et séchés avant qu’on imprime à leur surface les micro-alignements de sondes à l’aide de robots déposant des micro-gouttes de produit.

Fig.2. Impression de sondes microscopiques sur un disque Blu-ray. Crédit Ángel Maquieira.

Fig.2. Impression de sondes microscopiques sur un disque Blu-ray.
Crédit Ángel Maquieira.

Les robots d’impression sont munis de buses projetant de très faibles volumes de produits ( 25 à 50 nano-litres). Certains fonctionnent sans contact des buses avec la surface, d’autres avec contact. Le caractère hydrophobe plus élevé du revêtement du disque Blu-ray se traduit par une moindre mouillabilité et permet d’obtenir des sondes dix fois plus petites qu’avec les CD. La haute résolution optique du lecteur Blu-ray permet la détection de sondes de 85 µm de diamètre. De plus, la courte longueur d’onde du laser de lecture des disques Blu-ray fournit des images d’une plus grande netteté dûe à un meilleur rapport signal/bruit.

Les analyses réalisables avec ce procédé

I- On a d’abord testé cette technique pour l’analyse immunologique de microcystines dans les eaux, notamment les eaux potables.

Les microcystines sont des toxines bactériennes (il en existe plus de 70 variantes) produites par des bactéries pouvant proliférer en eau douce. Ces molécules, très résistantes, sont extrêmement dangereuses et ont causé la mort de nombreux animaux sauvages et domestiques. La quantité de ces toxines dans l’eau potable doit être maintenue en dessous de niveaux déterminés par l’Organisation Mondiale de la Santé (en anglais World Health Organization, WHO) (http;//www.who.int/water sanitation health/bathing/srwg1.pdf).

 

Pour cela, on a imprimé sur disque Blu-ray des alignements de 10×10 points d’un réactif à base d’albumine de sérum bovin (ASB) conjuguée à un haptène, antigène spécifique d’un anticorps monoclonal des microcystines.

Un haptène est une petite molécule qui ne peut susciter une réponse immunitaire, sauf si elle est liée chimiquement à une plus grosse molécule  comme une protéine sans propriété immunitaire.
Un anticorps est une molécule dirigée spécifiquement contre une autre molécule, l’antigène. Un anticorps est dit monoclonal quand il a été produit à l’aide d’une seule lignée de cellules (le clone). On peut  lier chimiquement (conjuguer)  à un anticorps ou un antigène une molécule particulière, un marqueur, susceptible d’être détectée par un procédé physique ou chimique
Fig.3. Schéma de l’analyse immunologique. Le conjugué du haptène est imprimé sur les micro-alignements. L’anticorps spécifique est celui de la microcystine recherchée, par exemple. L’anticorps marqué est un anticorps monoclonal qu’on fait agir sur le disque sonde pour faire une mesure différentielle de l’anticorps spécifique. La réduction des ions Ag+ en Ag0 sont ajoutés à la fin du traitement pour augmenter le contraste de l’image. Crédit Ángel Maquieira.

Fig.3. Schéma de l’analyse immunologique. Le conjugué du haptène est imprimé sur les micro-alignements. L’anticorps spécifique peut être, par exemple, celui de la microcystine recherchée. L’anticorps marqué est un anticorps monoclonal qu’on fait agir sur le disque sonde pour faire une mesure différentielle de l’anticorps spécifique. Les ions Ag+ se réduisant en Ag0 sont ajoutés à la fin du traitement pour augmenter le contraste de l’image. Crédit Ángel Maquieira.

 

On obtient ainsi une sensibilité de 0,93 µg/l qui est tout à fait comparable aux autres méthodes d’analyse des microcystines basées sur la fluorescence. La technique Blu-ray décrite ici a une meilleure sensibilité que celle avec DVD, elle utilise des volumes plus petits d’échantillon et de réactif. Quelques manipulations biochimiques (voir la vidéo) sont nécessaires avant la lecture du disque. L’analyse d’un échantillon prend une heure, ce qui est tout à fait raisonnable.

 

II- On a enfin utilisé la technique Blu-ray pour effectuer des analyses d’ADN par hybridation.

L’hybridation de l’ADN est fondée sur les propriétés d’appariement des bases complémentaires d’acides nucléiques. Elle est utilisée dans différentes techniques de mise en évidence de molécules d’acides nucléiques particulières.

Leurs résultats ont été comparés à ceux obtenus sur les mêmes échantillons par la méthode ACP (PCR).

L’Amplification en Chaîne par Polymérase, ACP (en anglais PCR, Polymerase Chain Reaction) est une technique de réplication ciblée in vitro. Elle permet d’obtenir en quelques heures, à partir d’un échantillon complexe et peu abondant des millions de copies d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie.                                                                                                                    Les polymérases sont des enzymes qui ont pour effet de synthétiser un brin de polynucléotide (ADN ou ARN).

Pour ces analyses d’ADN par hybridation, on imprime sur le disque Blu-ray un mélange de streptavidine et d’une sonde spécifique de l’ADN, un oligonucléotide (court segment d’acide nucléique) lié à de la biotine.

La streptavidine est une protéine purifiée à partir de la bactérie Streptomyces avidinii. Elle est très utilisée en biologie en raison de sa forte affinité avec la biotine. La biotine, vitamine B8, est une molécule intervenant dans la croissance cellulaire etla production d’acides gras et d’acides aminés par les êtres vivants.

 

Fig.4. Schéma de l’analyse par hybridation d’ADN.

Fig.4. Schéma de l’analyse par hybridation d’ADN.

Ces analyses ont porté sur l’ADN de Salmonella typhimurium et Cronobacter sakazaki, bien connus pour être responsables d’intoxications alimentaires chez l’homme. Les résultats ont été très concluants : la technique Blu-ray a atteint le même degré de sensibilité que la méthode classique (ACP) pour S. typhimurium et une sensibilité dix fois plus élevée pour C. sakazaki. Le faible volume d’échantillon nécessaire et la forte sensibilité offrent un grand avantage à cette méthode d’analyse ADN et permettent de traiter simultanément plusieurs échantillons.
La vidéo suivante montre les phases du procédé : du traitement chimique du disque porteur des sondes jusqu’à la lecture.

Crédit Ángel Maquieira.

L’utilisation de disques Blu-ray permet d’effectuer en une heure de temps simultanément plusieurs analyses immunologiques ou d’hybridation d’ADN . Cette technique, qui utilise les disques et lecteurs Blu-ray grand public fournit un outil d’analyse pratique, économique et performant. Elle devrait être d’un grand intérêt pour des tests de routine des résidus chimiques de l’industrie. Dans le domaine de la santé elle permettra la pratique d’analyses fines biologiques à des laboratoires à faible budget et de les réaliser rapidement sur le terrain.

 

 

Pour en savoir plus :

High density MicroArrays on Blu-ray discs for massive screening
Tania Arnandis-Chover,Sergi Morais, Miguel Ángel González-Martínez, Rosa Puchades and Ángel Maquieira
Biosensors and Bioelectronics 51(2014)109–114

Determination of Microcystins in River Waters Using Microsensor Arrays on Disk
Sergi Morais, Jesus Tamarit-Lopez, Rosa Puchades andÁngel Maquieira
Environ. Sci. Technol. 2010, 44, 9024–9029

Detection of food-borne pathogens with DNA arrays on disk T. Arnandis-Chover , S.Morais , L.A.Tortajada-Genaro , R.Puchades , Á. Maquieira , J. Berganza and G.Olabarr
Talanta, 2012, 101, 405-412

Compact Discs Technology for Clinical Analysis of Drugs. Maquieira, A.
In: Biosensors and Molecular Technologies for Cancer Diagnostics. K.E. Herold and A. Rasooly (Ed.), capt. 24, pages 417 – 440. Taylor & Francis. 2012. ISBN: 978-1-4398-4165-5. DOI: 10.1201/b12138-31.

 

 

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